Транскрипция,
ее регуляция,
и как ее изучают
(с помощью секвенирования и биоинформатики)

Ваня Кулаковский, Пущино-Москва

Часть 2: анализ ДНК-белкового узнавания in vivo

с помощью высокопроизводительных экспериментальных методов

Как фактор транскрипции находит свой геномный адрес?

Как нам выяснить его геномный адрес?

Догеномные методы: EMSA, "гель-шифт"

Догеномные методы: ДНКазный футпринтинг

SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)

SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)

Прямолинейное применение высокопроизводительного секвенирования: полногеномный футпринтинг - профилирование открытого хроматина (DNase-seq), и высокопроизводительный SELEX (HT-SELEX, SELEX-Seq).

ДНК-микрочипы для анализа экспрессии генов

Первые "большие" методы: гибридизация на микрочипах

Protein-binding microarray (PBM)

Первые "большие" методы: гибридизация на микрочипах

DNA-immunoprecipitation chip (DIP-chip)

ChIP-on-chip: теперь банановый in vivo

ChIP-on-chip

ChIP-Seq: chromatin immunoprecipitation
followed by deep sequencing

ChIP-exo: как ChIP-Seq только лучше

ChIP-exo: гораздо лучше (но есть подвох)

Cut & Run: еще лучше (и снова подвох)

"Several ChIP-free strategies have been developed for scChIP-seq."

Можно использовать для отдельных клеток:
scChIC-(immuno-cleavage)-seq [doi:10.1038/s41592-019-0361-7],
uliCUT&RUN [doi:10.1016/j.cell.2019.03.014] - в некоторых случаях достаточно всего 50 клеток (!)

Для анализа эпигеномов: CUT&Tag [doi:10.1038/s41467-019-09982-5] и аналоги на основе тагментации транспозазой Tn5.

Анализ данных ChIP-Seq

Контрольный эксперимент ChIP-Seq может быть

традиционный: секвенирование геномной ДНК (Input DNA) либо результатов неспецифической иммунопреципитации (нерелевантный белок, без антител; Mock IP),
альтернативный: ChIP-Seq при нокауте или нокдауне целевого белка,
оптимально спуленный: WACS (Awdeh et al., 2019, bioRxiv),
виртуальный: AIControl (Hiranuma et al., 2019, NAR).

A еще его может и не быть!

Базовая обработка и картирование прочтений

Димеры адаптерных последовательностей

Чаще используются короткие одиночные прочтения (проблема картируемости)

Прочтения (риды) это не сайты связывания и не связываемые фрагменты

Что делать с повторами?

The read mappers are designed to allow a (user-settable) number of mismatches in the reads, and it is important to choose this parameter to be appropriate with the NGS platform being used (consult the manufacturer).

Yet-another-Bioinformatics-Hell

Какой же программой искать пики?

Известные программы эпохи ранней популярности ChIP-Seq:
CisGenome не обновлялся с 2011;
FindPeaks не обновлялся, wiki с документацией недоступно более 5 лет;
SISSRs не обновлялся с 2008 (но все еще работает).

MACS: живой мамонт

Общая схема

Эмпирическая оценка длин фрагментов ДНК

Вспомним как получаются пики

И действительно относительный сдвиг прочтений видно невооруженным взглядом

MACS определяет характерную длину d "полезного" фрагмента и сдвигает прочтения в 3' направлении на d/2

Ожидаемая и наблюдаемая длина фрагмента после соникации

Число прочтений моделируется распределением Пуассона (где λ - ожидаемое число прочтений в окне)

Но бывают некоторые сложности

JetBrains Research SPAN

Чипсики - все ли так радужно?

Где эксперимент (IP) и где контроль?

Все наоборот

Шеф, у нас проблемы

Large-scale quality analysis of published ChIP-seq data, 2014

It is, for example, well appreciated that differential chromatin shearing efficiency can lead to the overrepresentation of areas of open chromatin (usually immediately surrounding transcribed promoters) in sequencing libraries. This has been termed the "Sono-seq" effect when attributed to sonication (Auerbach et al. 2009, Mapping accessible chromatin regions using Sono-Seq).

Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins, 2013

The localization of unrelated proteins, including the entire silencing complex, to the most highly transcribed genes was highly suggestive of a technical issue with the immunoprecipitations.

Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast, 2013

Another type of background bias stems from the inherent nucleosomal structure of chromatin, and can potentially make it seem like certain factors bind nucleosomes even when they don't.

Large-scale quality analysis of published ChIP-seq data, 2014

Data quality varied widely across "impact" levels. We separated datasets into groups according to the 2011 Thomson Reuters Impact Factor for the journal in which the corresponding article was published, and examined the distribution of QC scores in each group (Supplementary Figure 8). The group with highest impact factor (≥25) contained the largest fraction of datasets with a low QC { SPP in Kharchenko, 2008 } score of -2 or -1.

Using CisGenome to analyze ChIP-chip and ChIP-seq data, 2011

Users should look at the FDR and construct a final peak list using a FDR cutoff they are comfortable with (usually FDR = 10% or less). ...FDR below 25% is usually acceptable.

...enrichment in a given ChIP experiment depends on many intractable parameters, likely including a phase of a moon.

Чипсеки вредны?

Полезны, но при интерпретации нужно учитывать: глубину секвенирования, адекватность контроля, вычислительный пайплайн, дополнительные данные (например, анализ мотивов), воспроизводимость.

Что нам поможет? FastQC, ChIPQC https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/06_combine_chipQC_and_metrics.html

Черные списки http://mitra.stanford.edu/kundaje/akundaje/release/blacklists/

Рекомендации и стандарты проекта ENCODE

Мера невоспроизводимости
IDR (Irreproducible Discovery Rate)

Каков же геномный адрес факторов транскрипции?

“Although the function of these regions has not been assessed, our work in Drosophila suggests that many are active enhancers, which trigger gene transcription. However, because factors can bind DNA without functional consequences, especially at HOT regions, the contribution of each of the bound factors to enhancer activity remains unclear.”

Translation: Not every piece of chewing gum attached to the soles of your shoes is functional. Moreover, the function of the sole of your shoe to which the chewing gum stuck is NOT to bind chewing gum.

Dan Graur (Judge Starling) commenting ENCODE 2014 paper.

Пример из жизни

Пример из другой жизни

Пример из другой жизни

И красивые слайды

Самые полезные базы данных "про чипсеки"

ReMap - человек, арабидопсис (http://remap.univ-amu.fr/)

Cistrome - человек, мышь (http://cistrome.org/)

GTRD - все вподряд (http://gtrd.biouml.org/)

Каждый 1000й нуклеотид - отличается между двумя людьми (3 млн. замен). Но как сильно отличается регуляция генов?

Связывание факторов транскрипции определяется последовательностью!